Three-Photon成像

什么是三光子显微镜?

三光子显微镜是一种荧光显微镜技术，与双光子显微镜相比，荧光团几乎同时吸收三个光子。这些激发光子具有较长的波长和较低的能量比那些用于激发同一荧光团在单光子或双光子激发显微镜。

研究人员如何受益于使用三光子显微镜?

双光子激发显微镜促进了生命科学研究的基本发现。不幸的是，双光子技术有一些局限性。具体来说，在500微米及以下成像时，背景信号会增加，对比度会降低，从而无法解析结构或生理活动。相反，三光子激发显微镜中激发光的物理特性提供了更深层的成像和更好的激发约束，从而提供了比双光子显微镜更好的对比度和信号背景比(SBR)。

三光子显微镜的局限性是什么?

三光子成像普及的主要障碍是在长波长窗口的吸水率的预测增加，因为这种效应可能导致样品过热。然而，研究人员发现，三光子成像的最佳波长是在1300纳米和1700纳米窗口的吸收和散射之间的权衡。具体来说，在1300纳米处，吸收增加了2倍，散射也减少了近2倍，因此成像所需的激光功率更少。这表明有足够的空间来适应研究目标，同时遵守三光子显微镜的物理限制。三光子成像的便利性进一步平衡了这些限制，因为在双光子显微镜中使用的许多常用指标可以很容易地重新用于三光子成像。

同样重要的是要考虑适合三光子成像的特殊激光源和成像透镜的成本。这种应用通常需要两台激光器。为了增加三光子吸收的概率，研究人员必须使用具有高光子密度的光源。最常见的方法是基于高功率激光泵浦光参量放大器(OPA)，它从飞秒激光中获取一个波长的光，并将其转换为两个不同波长的光。由此产生的光束，称为空转光束，显示出比初始泵浦激光更长的波长，是三光子成像的理想选择。OPA是一种低重复激光(~1-4 MHz)，由于这一特性，不允许用30 Hz速度的谐振扫描仪成像。典型的成像速率小于10hz，视场更小，这可以随着激光技术的进步而改善。