timsTOF SCP

先进的离子光学和PASEF研究单细胞的细胞异质性和生物学
质谱蛋白质组学已经成为了解生物功能和疾病机制的现代研究的主要内容。看似同质的健康或病变组织是由具有多种不同蛋白质组的细胞组成的。破译每个单细胞中的蛋白质组的挑战——细胞异质性——是充分理解其功能的关键。
timsTOF SCP提供了一个从根本上改进的离子源概念。结合平行堆积序列破碎(PASEF)^®)获取方法，它提供了极高的速度和灵敏度来处理单细胞的蛋白质组或翻译后修饰在少数细胞的形态或功能相似。

timsTOF SCP具有改进的离子源几何形状，包括1毫米毛细管识别，可将5倍高的离子转移到额外的高压级离子漏斗和8级差抽真空系统中。

更大的毛细管产生超高灵敏度，额外的正交离子反射和随后的漏斗提供了一个单独的差分泵送级，保持了timsTOF仪器系列所期望的系统鲁棒性。

timsTOF SCP提供了离子传输到源的改进，同时保持了更高压力真空级的稳健性。这使得离子电流几乎提高了5倍。当与Evosep One Whisper方法结合使用时，以100 nL/min的流速运行，直径-

PASEF方法，灵敏度增益约100倍比以前的高流量结果与Evosep One实现。这使得真正单细胞水平的无偏见蛋白质组学具有良好的可重复性，稳健性和每个细胞约1500个蛋白质的覆盖范围。

捕获离子迁移谱法(TIMS)首先是一种气相分离技术。除了高效液相色谱(HPLC)和质谱分析外，通过增加分离维度来解决样品的复杂性，增加了峰容量和化合物表征的信心。

同样重要的是，TIMS装置还可以积累和浓缩给定质量和迁移率的离子，从而实现灵敏度和速度的独特提高。
双tims技术可以实现接近100%的占空比，有利于前部的积累，而后部的离子则根据其迁移率顺序释放。这种平行堆积序列破碎过程(PASEF)^®)可以进行碰撞截面(CCS)分析。

ccs支持的分析开辟了许多进一步的分析可能性，从更确定的化合物鉴定到自信的文库匹配，以及在大型数据集中降低错误发现率(fdr)。

除了无偏倚的真正单细胞蛋白质组学应用外，timsTOF SCP还为涉及蛋白质组中肽富集的工作流程提供了出色的灵敏度。免疫肽组学研究从血浆或组织中纯化免疫肽开始。

由于免疫肽在这些样品中的丰度相对较低，因此timsTOF SCP是免疫肽组学在可用材料有限的情况下发现新抗原的理想选择，如针活检。timsTOF SCP还具有革命性地使用磷蛋白组学研究癌症信号通路的敏感性。

利用捕获离子迁移谱法(TIMS)分离肽离子，洗脱(~ 100 ms)并在四极飞行时间(QTOF)中检测，生成TIMS ms热图。在PASEF中^®方法使用相同的TIMS分离与四极杆分离某一种离子在其洗脱过程中，并立即转移到下一个前体。母谱和碎片谱根据迁移率值排列。

平行堆积序列破碎(PASEF)^®)技术实现了> 100hz的测序速度。使用PASEF^®通过多次筛选，提高了低丰度肽的质谱质量。

PASEF^®非常适合猎枪蛋白质组学
由PASEF驱动的SCP的timsTOF^®提供>100赫兹的测序速度，而不会失去灵敏度或分辨率。这是通过同步四极分离质量窗口与特定肽包从TIMS漏斗的洗脱时间以及碰撞细胞中的碰撞能量来实现的。

timsTOF SCP允许以最小样品负载(<200 ng)在测序速度超过100 Hz和不受影响的蛋白质组学深度下分析数百个样品。这改变了蛋白质组学的研究方式，但增加的数据需要一个新的数据分析水平。

数据分析是许多工作流程中常见的瓶颈。现代分析方法产生了数百行由timsTOF SCP生成的数据。Bruker引入了实时数据库搜索功能——实时并行数据库搜索引擎(PaSER)，它消除了这个障碍。使用PaSER，一旦LC-MS运行完成，结果就可用-有效地运行和完成。

开放文件数据格式允许研究人员直接使用原始数据并使用他们选择的行业领先软件。

MaxQuant软件已适应管理空间中的四维(4D)特征，包括保留时间、离子迁移率、质量和信号强度。这有利于PASEF的多肽、蛋白质和翻译后修饰的鉴定和定量^®和dia-PASEF^®数据。

PEAKS Studio将从头测序与传统数据库搜索相结合，并针对处理timsTOF原始数据进行了优化。

读取原始数据的先进蛋白质组学处理软件解决方案的数量正在稳步增长，包括Biognosys的Spectronaut和SpectroMine软件以及Skyline, Genedata, Protein Metrics, Matrix Science, DIA-NN和MSFragger的Mascot Distiller软件。

支持ccs的分析，用于可靠的识别
timsControl允许自定义要关注的dia-PASEF窗口方案

感兴趣的离子。调整质量隔离宽度，TIMS范围和周期时间允许dia-PASEF适应不同的色谱方法。

结合在Evosep One系统上的低流量液相色谱与在timsTOF SCP上的dia-PASEF的高灵敏度的Whisper，从500 pg的细胞消化液中鉴定了2000多个蛋白质，从250 pg中鉴定了1500个蛋白质，证明了真正的单细胞蛋白质组学所需的灵敏度。从250 pg鉴定的蛋白质覆盖了约4个数量级的丰度范围，可以在单细胞水平上进行定量蛋白质组分析。

了解TME及其浸润的免疫细胞被认为是影响疾病进展、治疗反应和患者生存的关键一步。由于其高灵敏度，timsTOF SCP能够对激光捕获显微解剖(LMD)从FFPE组织样本中切除的细胞进行足够的蛋白质组深度。典型的工作流程如右图所示。

细胞标记用于识别肿瘤肿块中的黑色素瘤癌细胞和与基质密切相关的细胞，随后通过LMD和在timsTOF SCP仪器上进行无偏4d -蛋白质组学分析分离这两个群体。

关键发现:富集分析揭示了中枢和外周黑色素瘤细胞之间的差异调节蛋白，具有指导临床决策的疾病亚型潜力。
结果由Matthias Mann教授提供(doi:https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933）