Путеводитель по о Раман мик оскопи
Основы с амано оско о ко ко ии
Что тако о рам мано ос ска ам мик оскопи ?
О Рамановской мик О ск О пи
Рамановскаямикроскопия(µ-Раман)представляетсобойкомбинациюобычнойоптическоймикроскопиииуникальнойхимическойидентификацииспомощьюрамановскойспектроскопии。
Обаметодадостаточноэффективнысамипосеб,еновсочетаниионидаютвозможностьхимическогоисследованиямельчайшихобъектов(> 0,5мкм),итакимобразом,комбинируютспектральнуюинформациюспространственной。
Вотличиеотинфракрасноймикроскопии,Рамановскиемикроскопыгораздопрощевприменении,посколькувнихиспользуетсяизлучени,еподходящеедлявпростойстекляннойоптики。ПоэтомуРамановскиемикроскопычастосоздаютсянаосновеоптическихмикроскоповдостаточновысокогокачества。
О в О О О к ке и к О нф О кали
Какправило,ивзависимостиотаналитическойзадач,иникакихсложныхпреперпарацийвыборкивРаманмикроскопиинетребуется。Какправило,образцыпомещаютсяподмикроскопию,какесть。Вбольшинствеслучаев,поперечныесеченияподготовленыилибольшиезаготовкиразрезаютсядоразмера,чтобыпоместитьсянасцене。
Темнемене,етежеограниченияобразца,каквРаманспектроскопииппо——режнемуприменяютсяиобразецнеможетпоказатьсильнуюфлуоресценциюилипоглощениевосклицательнойдлиныволны。
Некоторыеобразцытребуютконфокальногорамановскогомикроскопа,которыйпредлагаетпространственноеразрешениевовсехтрехизмерениях。Такимобразом,выможетеизмеритьвнутриконтейнеров(например,стеклянныефлаконы)илиохарактеризоватьобразцыв3 d。
Калибровка Рамановского мик ко скопа
ДляполученияточныхинадежныхрезультатовсРамановскогомикроскопанеобходиматочнаякалибровкапоосидлинволн。МногиеизменениявработеРамановскогомикроскопаобычнодостаточносерьёзновлияютнаточностьпошкалеволновыхчисел。
(Повторная)калибровкавыполняетсяпутемизмерениякремниевогостандарта,носовременныемикроскопыпредполагаютнепрерывнуюкалибровкудлямаксимальногоудобства。
Есликалибровканевыполняетсянепрерывно,повторнаякалибровкадолжнавыполнятьсярегулярнодажепослекажущихсянезначительнымиперенастроекприбора,такихкакизменениелазера,диафрагмыилирешетки,внезапныеударыивибраци,иатакжетемпературныесдвигииколебания,чтобыобеспечитьоптимальныеспектральныеданные。
Что тако ое спект ал но ое з е е е и ?Что тако о прост та нст т енн енное р р з е е е и ?
Спектральноеразрешениеопределяетспособностьразделятьблизкорасположенныетонкиепикипоглощениянаспектре。Еслионослишкомнизко,енекоторыеспектральныепикипревращаютсявширокие«полосы»。
Еслиразрешениеслишкомвысокое,измерениезайметнамногобольшевремени,безкаки,хлибопреимуществдляпользователя。Поэтомуважнознать,какоеспектральноеразрешениеидеальноподходитдляконкретногообразца。Чтоделаетразрешение«слишкомнизкими”ли«слишкомвысоким»,зависитотсоответствующейаналитическойзадачи。
Пространственноеразрешениеважно,посколькуоноопределяет,насколькорезкомывидимобъекты。ВРамановскоймикроскопиикрайневажноразличатьразличныеструктурывобразце。Следовательно,чемлучшепространственноеразрешени,етембольшедеталейизображениямывидим。
Латеральноеиаксиальноеразрешениепредставляютсобойразличныепараметры。ДлядостижениянаивысшегоразрешениявобоихслучаяхнеобходимоиспользоватьконфокальныйРамановскиймикроскоп。ОбычнопространственноеразрешениеявляетсярешающимпараметромприпостроенииРамановскихизображений。
Что тако ок о о онфокали и ност ?Почему ?
Воптическоймикроскопии,confocalityозначает,чтоосвещенныйобразецпятнаиотверстиеотверстиевпутилучаобаимеютодинитотжекоординационныйцентр。Впрактическомплан,евместовсегообразца,лишьнебольшаячастьосвещаетсяточечнымисточникомсвета。Затемпинхолблокируетнецеленаправленныйсвет,темсамымувеличиваяконтрастностьиглубинурезкости。
Что тако ок ок онфокал н ии Раман мик оскопи ?
Этотпринципможетбытьпримененкрамановскойспектроскопи,итемсамымповышаяпространственноеразрешениевдольx, y -(боковой)иz -оси(глубина),атакжепозволяяпрофилированиеглубины。Раманмикроскопы,однако,могутотличатьсяпосвоемуконфокальныйдизайн。
Истинный конф - окал н о из з
Самымбольшимпреимуществомистинногоконфокальногораманскогомикроскопаявляетсянезависимыйконтрольпространственногоиспектральногоразрешения。Этодостигаетсяпутемразмещенияотверстияотверстиепередспектрометромвходнойщели。Переменныеотверстияконтролируютстепеньконфокальности,втовремякаквходнаящельконтролируетспектральноеразрешениеспектрометра。Недостаткомэтойконструкцииявляютсятрудности,скоторымисталкиваютсяприпопыткесохранитьобаотверстияидеальновыровненыдляподдержанияоптимальнойпроизводительности。
Псевдо-конфокальныйдизайн
ВупрощеннойконфигурациипространственноеразрешениеможетуправлятьсясочетаниемвходнойщеливодномнаправленииипространственнымразрешениемдетектораCCDвортогоническомнаправлении。Ограниченияспектрографаприводяткнизкойпроизводительности,когдаделодоходитдопространственногоразрешения,нозасчетсокращенияколичестваоптикивпсевдо-конфокальныхустановки,общаяпропускнаяспособностьзначительноулучшается。
Гибридно-конф - окал н диза (FlexFocus)
Таккакоб,авысокаяжелобаиистинныйконфокальныйдизайнпредлагаюточевидныепреимущества,Раманмикроскопможетбытьоснащенгибриднойдиафрагмымасси,всодержащийнаборпинхоловищелей,которыемогутвыступатьвкачествеконфокальногодиафрагмыиспектрографаentranc。Этотгибридныйдизайнсочетаетвсебепреимуществаэтихдвухконструкцийипозволяетпотребованиюполучитьдоступкистиннойконфокальныеиливысокойпропускнойспособностиустановки。
Раман Микроскопия и асто зада аем и т вопросы
Частозадаваемыевопросыорамановскоймикроскопии
В м ем преимущества амано ско ос пект о оско опи ?
Рамановскаяспектроскопияимеетнесколькоосновныхпреимуществпосравнениюсдругимиметодамиколебательнойспектроскопи,итакимикакИК——ФурьеспектроскопияиспектроскопияближнегоИК——диапазона。ВотличиеотпоглощенияИК——излучения,эффекткомбинационногорассеяниясвета(Раман)представляетсобойнеупругоерассеяниесветанаобразце。Рамановскаяспектроскопиянетребуетилитребуетнезначительнойподготовкипробприизмерениитвердыхвеществ,жидкостейигазов,нетольконапрямую,ноичерезпрозрачныеокна,такиекакстеклоипластик。Водаимееточеньнизкийсигналкомбинационногорассеяниясвета,ипоэтомуспектроскопиякомбинационногорассеяниячувствительнаксоединениям,растворенныевводе,безсильныхпомех。Этоделаетрамановскуюспектроскопиюприменимойдлябиологическихобразцоввихестественномсостоянии。
Скольковременинужно,чтобыполучитьрамановскийспектр吗?
Времяэкспозициизависитотмногихфакторов,такихкакожидаемоекачествоспектра,мощностьлазераисечениерамановскогорассеянияобразца。Обычноспектрыкомбинационногорассеянияхорошегокачестваможнополучитьвтечениенесколькихсекунд。
Можнолиполучитьспектрыкомбинационногорассеяниядлясмесиматериалов?
Рамановскийспектрсодержитинформациюобовсехмолекулахобразца。Следовательно,спектрыкомбинационногорассеяниясвета,полученныедлясмеси,содержатпикиотразличныхмолекул。Еслиспектрыотдельныхкомпонентовизвестны,можнополучитьколичественнуюинформациюосоставе。
Какуюещеинформациюможнообнаружитьспомощьюкомбинационногорассеяния,кромехимическойструктуры吗?
Рамановскаяспектроскопияможетпрямоиликосвенноотразитьразличнуюинформацию,такуюкакналичиеразличныхизотоповвмолекулах,аллотропы,кристалличность,полиморфизм,легированиекристаллическойрешетки,напряжение,давлениеитемпература。
Являетсялирамановскаяспектроскопияколичественной吗?
Интенсивностьспектральныхпиковлинейнозависитотконцентрации。Соотношениемеждуинтенсивностьюпикаиконцентрациейможнокалиброватьспомощьюизвестныхобразцов。Всмесяхпикикомбинационногорассеяния,помимопрочего,несутколичественнуюинформациюоконцентрациисоединений。
Какаядлинаволнылазералучшевсегоподходитдлямоихзадач吗?
Наилучшаядлинаволнылазерадляконкретнойзадачиневсегдаочевидна。Дляоптимизациидлиныволнывозбуждениянеобходимоучитыватьмногиепараметры。Эффективностьрассеяния,влияниефлуоресценции,эффективностьдетектора,атакжеэкономическаяцелесообразностьипростотаработыявляютсяосновнымиаспектами,которыенеобходимоучитывать。Постатистикенаиболеечастоиспользуемыйдлиныволнвозбуждения785нми/ил523ним。532年нмособенноподходитдлянеорганическихматериалов,напримерграфенаифуллеренов。
Каковатипичнаямощностьлазерадлярамановскихизмерений吗?
МощностьлазеранаобразцеврамановскоммикроскопеобычносоставляетотдолеймВтдонесколькихдесятковмВт。Рамановскаяинтенсивностьпрямопропорциональнамощностилазера。Однакосуществуетповышенныйрискповрежденияобразцаприиспользованиимощноголазера。Мощностьлазераможноуменьшить,чтобыизбежатьповрежденияобразца,ноприэтомнампотребуетсяболеедлительноевремяэкспозиции,чтобыполучитьспектрыхорошегокачества。
