Three-Photon成像

什么是三光子显微镜?

三光子显微镜是一种荧光显微镜技术，与双光子显微镜相比，荧光团几乎同时吸收三个光子。这些激发光子比在单光子或双光子激发显微镜中用于激发相同荧光团的光子具有更长的波长和更低的能量。

研究人员如何从使用三光子显微镜中获益?

双光子激发显微镜促进了生命科学研究的基本发现。不幸的是，双光子技术受到一些限制。具体来说，当在500µm及以下成像时，背景信号增加，对比度降低，使得无法分辨结构或生理活动。相反，在三光子激发显微镜中，激发光的物理特性提供了更深入的成像和更好的激发限制，从而提供比双光子显微镜更好的对比度和信背景比(SBR)。

三光子显微镜的局限性是什么?

普及三光子成像的主要障碍是预测长波窗吸水率的增加，因为这种影响可能导致样品过热。然而，研究人员发现，三光子成像的最佳波长是在1300 nm和1700 nm窗口的吸收和散射之间进行权衡。具体来说，在1300nm处，吸收增加了2倍，但散射也几乎减少了2倍，因此，成像需要更少的激光功率。这表明有足够的空间来适应研究目标，同时符合三光子显微镜的物理限制。三光子成像的便利性进一步平衡了这些限制，因为在双光子显微镜中使用的许多常见指标可以很容易地重新用于三光子成像。

此外，还需要考虑适合三光子成像的专用激光光源和成像透镜的成本。通常，这种应用需要两个激光器。为了增加三光子吸收的可能性，研究人员必须使用具有高光子密度的光源。最常见的方法是基于高功率激光泵浦光参量放大器(OPA)，它从飞秒激光中获取一个波长的光，并将其转换成两个不同波长的光。由此产生的光束被称为空转光束，其波长比最初的泵浦激光器更长，是三光子成像的理想选择。OPA是一种低重复激光器(~1-4 MHz)，由于这种特性，不允许用30 Hz速度的谐振扫描仪进行成像。典型的成像速率小于10赫兹，视野更小，这可以随着激光技术的进步而改善。